Materials
- 培養中の MEF
- 500 ug/ml MMC stock, -20°C
- DMEM/10% FBS/PS
500 ug/ml MMC stock の調製
- 10 mg の MMC (mitomycin C) (Wako, 134-07911) を 20 ml の PBS(-) に溶かす。
- 400 ul ずつ分注し、-20°C 保存。
Protocol
Day 1
- 10 cm dish １枚 (10 ml) に、200 ul の MMC stock (終濃度 10 ug/ml) を加える。
培養中の培養液に直接 MMC stock を加える。 - CO2 インキュベーション, 37°C, 2 h。
時間厳守。長時間 MMC で処理すると MEF が死ぬ。 - 培養液を交換する。
- CO2 インキュベーション, 37°C, O/N。
Day 2
MMC 処理した MEF は MEF-MMC と記載して区別する。
- トリプシンで MEF-MMC を剥がし、細胞数を計測する。
- 5.0×105 cells/500 ul CultureSure で凍結保存。
5.0×105 の MEF-MMC 凍結ストックは、6 cm ゼラチンディッシュ１枚、もしくは 3 cm ゼラチンディッシュ２枚に播種して使用する。