分子細胞機能学研究室

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Materials

• 妊娠13日目の ICR マウス
• PBS(-), 4°C
• DMEM/10% FBS/PS, 4°C
• Amphotericin B [Fungizone] (×100, 250 ug/ml) (Wako, 019-23891), -20°C
• 解剖用具
• 10 cm ペトリディッシュ
• 10 ml シリンジ (テルモ, SS-10EZP)
• 18 G 注射針 (テルモ, NN-1838R)
• 10 cm dish (non-coat)

Protocol

Day 0

1. ペトリディッシュ４枚と 50 ml チューブに 20 ml の PBS(-) を入れる。
2. マウスを頚椎脱臼で安楽死させる。
3. 開腹して子宮を摘出し、ペトリディッシュ (1) に移す。
4. 子宮を切開し、羊膜に包まれた胎児を露出させる。
5. 羊膜と胎盤を除去した胎児を、ペトリディッシュ (2) に移す。
6. 上記の作業を繰り返し、全ての胎児を摘出する。
7. １匹の胎児をペトリディッシュ (3) に移す。
8. 実体顕微鏡下で、頭を切断し、内臓 (赤い部分) を除去する。
   PBS(-) が汚れてきたら、ペトリディッシュ (4) と交換する。
9. 胎児の組織塊を 50 ml チューブに移す。
10. 上記の作業を繰り返し、全ての胎児を処理する。
11. 以下の作業は安全キャビネット内で行う。
12. アスピレーターで 50 ml チューブの PBS(-) を除去する。
    PBS(-) は、組織塊が浸かっている程度には残す。
13. 10 cm dish に 10 ml の DMEM/10% FBS/PS と 100 ul の amphotericin B (終濃度 2.5 ug/ml) を入れる。
14. 18 G の針を装着した 10 ml シリンジで、１匹分の組織塊を吸着し、10 cm dish に移す。
    PBS(-) は可能な限り 10 cm dish に移さない。
15. シリンジで、ゆっくりと培養液ごと組織塊を吸い、出す, 3回。
    組織塊を砕き過ぎないようにする。
16. 上記の操作を胎児の数だけ行う (胎児の数だけ 10 cm dish を作る)。
17. CO₂ インキュベーション, 37°C, O/N。

Day 1 以降

• ３日ごとに、３倍の枚数の dish に継代する。日数や枚数は細胞の様子を見て調整する。
• ES/iPS 細胞のフィーダーとして使う場合は、MEF を MMC 処理する。