細胞の継代

Materials

DMEM/10% FBS/PS, 4°C
細胞の培養に適切な培地, 4°C
PBS(-), 4°C
トリプシン (0.25% trypsin/1 mM EDTA) (Wako, 209-16941), 4°C

Protocol: 10 cm dish １枚から５枚に継代する場合

顕微鏡で細胞の状態を確認する。
アスピレーターで dish の培地を除去する。
5 ml の PBS(-) を加える。Dish を軽く揺らして wash する。
トリプシンは Ca²⁺/Mg²⁺ によって失活するので、培地の FBS に含まれる Ca²⁺/Mg²⁺ を PBS(-) で洗い流す。
アスピレーターで dish から PBS(-) を除去する。
1 ml のトリプシンを加える。
Dish を傾けてトリプシンを均一に (特に dish 中央に) 行き渡らせる。
インキュベーション, 37°C, 3 min。
Dish を軽く叩いて細胞を dish から剥がす。
細胞が１~数個に解離されて浮遊しているかを顕微鏡で確認する。
トリプシンの効果が不十分な場合は、インキュベーション時間を延長する。
5 ml の DMEM/10% FBS/PS を加える。
培地の FBS に含まれる Ca²⁺/Mg²⁺ によってトリプシンが失活する。
培地で dish を洗いながらピペッティングし、細胞を懸濁する。
細胞懸濁液を 15 ml チューブに移す。
必要に応じて細胞数を計測する。
遠心, 1500 rpm, RT, 3 min。
遠心中に、新しい dish 5枚に、9 ml ずつ培地を加えておく。
沈殿している細胞を吸わないように、アスピレーターで上清を除去する。
5 ml (継代する枚数 × 1 ml) の培地で細胞を懸濁する。
新しい dish に 1 ml ずつ細胞懸濁液を加える。
インキュベーターに dish を置き、細胞が均一になるように揺らす。
インキュベーション, 37°C, O/N。

継代した dish は細胞が接着するまで動かさない。次に観察するのは翌朝以降。