分子細胞機能学研究室

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Materials

• 形質転換した大腸菌の LB plate
• LB (+抗生物質) medium, 4°C
• LB plate, 4°C
• GTE (50 mM グルコース/25 mM Tris-HCl, pH 8.0/10 mM EDTA)
• 0.2 N NaOH/1% SDS
• 4 M 酢酸カリウム
• 5 M LiCl

Protocol: 大腸菌の培養とコピープレートの作成

• 必要であれば 30 ul の X-gal 溶液を LB plate に塗布し、RT or 37°C で乾燥させておく。

1. 15 ml チューブに 2 ml の LB medium を入れる。
2. LB plate の大腸菌コロニーを 200 ul チップでつつく。
3. そのまま、200 ul チップで新しい LB plate (コピープレート) をつつき、コロニーをコピーする。
4. 200 ul チップを 15 ml チューブに入れる。
5. 15 ml チューブのキャップを固く閉じ、シェーカーで培養する, 250 rpm, 37°C, O/N。
6. コピープレートを 37°C インキュベーターで培養する, O/N。

Protocol: miniprep

• コピープレートにコロニーが生えていることを確認し、4°C 保存。

1. 15 ml チューブから 1 ml の LB medium を 1.5 ml チューブに移す。
2. 遠心, 13000 rpm, RT, 1 min。
3. 沈殿した大腸菌を吸わないように、アスピレーターで上清を吸い出す。
4. 100 ul の GTE を加え、ボルテックスで大腸菌の沈殿を完全に懸濁する。
5. 200 ul の 0.2 N NaoH/1% SDS を加え、転倒混和する。
6. 150 ul の 4 M 酢酸カリウムを加え、転倒混和する。
7. 450 ul の 5 M LiCl を加え、転倒混和する。
8. 氷上でインキュベーション, 5 min。
9. 遠心, 13000 rpm, RT, 10 min。
10. 800 ul の上清を新しい 1.5 ml チューブに移す。
    上清は 800 ul 以上あるが、移すのは 800 ul だけで良い。それ以上はチューブに入らない。
11. 700 ul のイソプロパノールを加え、転倒混和する。
12. 遠心, 13000 rpm, RT, 10 min。
13. デカントで上清をアルコール廃液として捨てる。
14. 500 ul の 75% EtOH を加える。
15. 遠心, 13000 rpm, RT, 5 min。
16. 200 ul のピペットで上清をアルコール廃液として捨てる。
17. チューブのフタを開けて静置し、乾燥させる。
18. 20 ul の MQ を加えてプラスミドを溶解する。
19. -20°C 保存。制限酵素処理、電気泳動などには 5 ul のプラスミド溶液を使う。