新規 GATA4 結合タンパク質である Cdk9 は GATA4 を介して心筋肥大反応遺伝子のプロモーター上にリクルートされる

新規 GATA4 結合タンパク質である Cdk9 は GATA4 を介して心筋肥大反応遺伝子のプロモーター上にリクルートされる

砂川陽一1,2,3, 森本達也2, 高谷智英1,3, 川村晃久3, 和田啓道3, 鶏内伸二1, 島津章3, 木村剛1, 藤田正俊1, 長谷川浩二3.

  1. 京都大学大学院医学研究科.
  2. 静岡県立大学薬学部.
  3. 国立病院機構京都医療センター.

第19回日本病院薬剤師会東海ブロック学術大会・平成21年度日本薬学会東海支部例会 (四日市), 2009/11/23 (ポスター).

Abstract

【目的】我々は心筋細胞肥大反応の核内分子メカニズムを解明するために、心筋特異的転写因子 GATA4 の結合因子のプロテオミクス解析を行い、新たな GATA4 結合因子として P-TEFb (Positive Transcription Elongation Factor b) の構成因子である Cdk9 を同定した。GATA4 は内因性ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性を持つ p300 と協調的に作用し、肥大反応遺伝子の転写を調整しているが、これに Cdk9 がどのように関わってくるかは分かっていない。そこで本研究の目的は、Cdk9 が GATA4/p300 と機能的コンプレックスを形成するか、心筋細胞肥大反応遺伝子制御にどのように関与するかを検討することである。

【方法と結果】COS 細胞を用いた、免疫沈降-ウェスタンブロット実験で、Cdk9 は、RNA ポリメラーゼ II の高リン酸化だけでなく、p300 のリン酸化と GATA4 のアセチル化を誘導させた。ゲルシフトアッセイにより、p300 は GATA4 の DNA 結合能を亢進した。Cdk9 のキナーゼ活性を喪失した Cdk9 のドミナントネガティブ体は、これらを抑制した。クロマチン沈降 (ChIP) アッセイおよび DNA pull-down アッセイにより、GATA4 はエンドセリン-1 のプロモーター内の GATA エレメントに Cdk9 をリクルートすることを見出した。

培養心筋細胞において、ChIP および re-ChIP アッセイにより、GATA4 は Cdk9 および p300 を肥大反応遺伝子のプロモーター上にリクルートし、複合体を形成した。この DNA 結合能はフェニレフリン刺激により増加した。また、フェニレフリン刺激により p300 のリン酸化、GATA4 と Cdk9 の結合、および GATA4 のアセチル化が亢進した。

【考察】以上より、Cdk9 は、そのキナーゼ活性が p300 のリン酸化や HAT 活性に必須であり、GATA4/p300 と機能的コンプレックスを肥大反応遺伝子プロモーター上で形成することが判明した。