Materials
- 96-well プレート (BIO-BIK, 133072) または８連チューブ (アズワン, 1-1599-03)
- qPCR 用８連キャップ (Applied Biosystems, 4323032)
Protocol
プレート作成前に Dice 本体の電源を入れておく。本体の「STANDBY」が点滅中は使用不可、点灯したら使用可。
- プレートを Dice にセットする。
- PC のデスクトップの「TaKaRa DiceRealTime Single」を起動する。
- メニューバーのランプのアイコンがオン (黄色)、画面右下の「Instrument」と「Camera」が「Connected」であることを確認する。
- 「File」→「New」で実験を新規作成する。
- 「Experiment Type」の画面で「RQ: Relative Quantification」を選択し、「OK」を押す。
- 左上が「Plate Setup」、タブが「Target & Sample Setting」の画面で、以下の設定を行う。
- Target:「Type」は「TOI」(target of interest) を選択。
- Target:「Dye」は「FAM」になっていることを確認。
- Target:「Name」に遺伝子名を入力。遺伝子の数だけ繰り返す。
- Sample:「Type」は「UNKN」(unknown) を選択。
- Sample:「Name」にサンプル名を入力。サンプルの数だけ繰り返す。
- 入力が終了したら、画面右下の「Update」ボタンを押す。
- タブが「Plate Image」の画面になるので、well を選択して遺伝子名とサンプル名を設定する。
- 左上が「Thermal Profile Setup」で以下の設定を行う。
- 画面左上の「FAM」がチェックされていることを確認。
- 「Speed」を「Normal」に設定 (デフォルトは「Fast」)。
- 画面下側の「Pattern」から「Dissociation」を選択し、「Add Pattern」ボタンを押す。
- 「Start Run」ボタンを押し、実験ファイルを保存すると qPCR が始まる (90 min)。
- 左上が「Result / Analysis」の画面で、以下の設定を行う。
- 画面左上の「Filter」の「FAM」をクリックしてオンにする。
- 画面右上の「Full」をクリックして、グラフを１画面にする。
- グラフの Y 軸を右クリックし、「Y axis」→「Scale」→「Log」で対数表示にする。
- 画面右下の「Selector」をクリックし、プレートの画面を出しておく。
- qPCR が終了したら、「Analysis Data」から「Text Report」を選択する。
- 「Column」の「Target Name」と「Sample Name」をチェックする。
- Well を選択してデータを表示させたら右クリックし、「Export Data」→「Excel」でファイルを保存する。
- 解析には「Ct (CP)」値を用いる。「Ct (SDM)」は使わない。