分子細胞機能学研究室

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Materials

• PBS(-), 染色用, RT
• 0.01% Triton in PBS(-), 4°C
• 0.2% Triton in PBS(-), 4°C
• 2% PFA in PBS(-), 4°C
• 1% BSA in PBS(-), 4°C
• 一次抗体, 4°C or -20°C
• 二次抗体, 4°C
• DAPI in PBS(-), 4°C
• マウンティングメディウム (ibidi, ib50001), 4°C
• PAP ペン (アズワン, 1-5902-01)
• カバーガラス (22×22 mm; アズワン, 1-877-03)

Protocol

Day 1

1. 1 ml の PBS(-) で wash, 2回。
2. 1 ml の 2% PFA を加えて固定する。RT, 5 min。
3. 1 ml の 0.01% Triton で wash, 2回。
   0.01% Triton に浸した状態で、4°C で保存可能。
4. 1 ml の 0.2% Triton を加えて透過処理 (細胞膜に孔を開ける)。RT, 5 min。
5. 1 ml の 0.01% Triton で wash, 1回。
6. PAP ペンで dish の外周をマスクする。
7. 200 ul の 1% BSA を加えてブロッキング。RT, 30 min。
8. 一次抗体を 1% BSA で希釈する。
9. 7. で加えた 1% BSA を捨て、200 ul の一次抗体希釈液を加える。
10. インキュベーション, 4°C, O/N。

Day 2

1. 二次抗体を 1% BSA で希釈する。
2. 200 ul の 0.01% Triton で wash, 2回。
3. 200 ul の二次抗体希釈液を加える。
4. アルミホイルで遮光してインキュベーション, RT, 1 hr。
5. 200 ul の 0.01% Triton で wash, 2回。
6. 200 ul の DAPI を加える。
7. インキュベーション, RT, 5 min。
8. DAPI を除去し、マウンティングメディウムを 1-2 滴垂らす。
9. カバーガラスで封入する。
10. 顕微鏡で観察・撮影する。