抗ヌクレオリンアプタマー iSN04 は BMP2 依存的な骨分化を抑制する

抗ヌクレオリンアプタマー iSN04 は BMP2 依存的な骨分化を抑制する

松島もも, 高谷智英.

日本核酸医薬学会第9回年会 (仙台), 2024/07/16 (ポスター).

Abstract

本研究室で同定された18塩基の抗ヌクレオリンアプタマー iSN04 (5’-AGA TTA GGG TGA GGG TGA-3’) は、骨格筋前駆細胞、心筋前駆細胞、血管平滑筋の分化を促進する一方、脂肪前駆細胞の分化を抑制する。筋系列細胞と非筋系列細胞は、間葉系幹細胞から排他的に分化することから、iSN04 は、同じく間葉系に由来する骨芽細胞の分化も抑制すると考えられる。本研究では、マウス骨芽細胞株 MC3T3-E1 の分化・石灰化における iSN04 の作用を検討した。

免疫染色により、ヌクレオリンは MC3T3-E1 の分化を通じて核内に局在することがわかった。蛍光標識した iSN04 は120分以内に MC3T3-E1 の細胞質および核内に拡散したことから、iSN04 は抗ヌクレオリンアプタマーとして作用し得ることを認めた。次に、MC3T3-E1 に BMP2 を48時間投与して分化誘導した。骨分化マーカーであるアルカリフォスファターゼ (ALP) の活性は BMP2 投与群で有意に増加したが、この BMP2 依存的な ALP 活性は iSN04 の投与で有意に抑制された。同様に、骨分化マーカー遺伝子 (Bglap2, Alpl) の発現量は、BMP2 群で有意に増加し、BMP2+iSN04 投与群で有意に減少した。骨細胞の石灰化においても、BMP2 による石灰化が iSN04 投与で抑制された。また、iSN04 は、アスコルビン酸で誘導される骨分化および石灰化も抑制した。以上の結果から、iSN04 によるヌクレオリンの阻害は、BMP2 依存的な骨分化・石灰化を抑制することが明らかになった。現在、BMP2 による Smad のリン酸化や核内移行における iSN04 の作用を検討している。iSN04 の詳細な作用機序を解明することで、過剰な BMP シグナルによる異所性骨化の治療への iSN04 の応用が期待される。

An 18-base anti-nucleolin aptamer, iSN04 (5’-AGA TTA GGG TGA GGG TGA-3’), promotes myogenic differentiation of skeletal, cardiac, and vascular smooth muscle cells, but inhibits adipogenic differentiation. Muscular and non-muscular lineages are derived exclusively from mesenchymal stem cells, suggesting that iSN04 would interfere with the differentiation of osteoblasts, which are also derived from the mesenchyme. This study investigated the effect of iSN04 on the differentiation and calcification of the murine osteoblast cell line MC3T3-E1.

Immunostaining revealed that nucleolin localized to the nuclei of MC3T3-E1 during differentiation. Fluorescence-labeled iSN04 was incorporated and diffused into the cytoplasm and nucleoplasm of MC3T3-E1 within 120 min, indicating that iSN04 can act as an anti-nucleolin aptamer in MC3T3-E1. Next, MC3T3-E1 cells were treated with BMP2 and induced to differentiate for 48 h. The activity of alkaline phosphatase (ALP), a bone differentiation marker, was significantly increased in the BMP2-treated group, but this BMP2-induced ALP activity was significantly suppressed by iSN04. Similarly, the expression levels of bone marker genes (Bglap2, Alpl) were significantly increased in the BMP2 group and significantly decreased in the BMP2+iSN04 group. iSN04 also suppressed BMP2-dependent calcification of MC3T3-E1-derived osteocytes. In addition, iSN04 also inhibited differentiation and calcification of MC3T3-E1 treated with ascorbic acid. These results demonstrate that nucleolin inhibition by iSN04 suppresses BMP-dependent differentiation and calcification. The effect of iSN04 on BMP2-induced phosphorylation and nuclear translocation of Smad will be presented. Elucidation of the fine mechanism of action of iSN04 will make iSN04 beneficial for the treatment of heterotopic ossification caused by excessive BMP signaling.