骨形成型オリゴ DNA はインスリン依存的に軟骨分化を促進する

骨形成型オリゴ DNA はインスリン依存的に軟骨分化を促進する

木村智勇, 高谷智英.

日本核酸医薬学会第9回年会 (仙台), 2024/07/16 (ポスター).

Abstract

我々は骨芽細胞の分化を TLR9 非依存的に促進する18塩基の骨形成型オリゴ DNA、iSN40 (5’-GGA ACG ATC CTC AAG CTT-3’) を同定した。軟骨膜の前駆細胞は骨と軟骨の両方に分化するなど、骨・軟骨分化は密接に関連している。変形性関節症では、関節軟骨が摩耗して骨組織が増殖し、炎症や痛みによる歩行障害や寝たきりが生じる。現在、幹細胞を用いた関節再生医療は保険適用外であり、軟骨分化の促進分子や誘導法の開発が希求されている。本研究では、マウス軟骨前駆細胞株 ATDC5 の軟骨分化における iSN40 の作用を調べた。

ATDC5 に 10 ug/ml のインスリンを投与して軟骨分化を誘導した。分化誘導開始と同時に、10 uM の iSN40 または iSN40-GC を投与した。iSN40-GC は、iSN40 の TLR9 認識配列である CG を GC に置換した配列で、iSN40 同様に骨分化を促進することがわかっている。分化誘導８日目に軟骨の基質であるコラーゲンをシリウスレッドで、プロテオグリカンをアルシアンブルーで染色し、軟骨分化を評価した。シリウスレッドおよびアルシアンブルーの染色強度は、インスリン投与群で有意に増加し、インスリンに加えて iSN40 または iSN40-GC を投与することでさらに増強された。一方、iSN40 を単体で投与しても ATDC5 の軟骨分化に影響しなかった。分化誘導８日目に定量 PCR をした結果、軟骨基質である２型コラーゲン (Col2a1) とアグリカン (Acan) の発現の発現量は、インスリン投与群で増加し、インスリン＋iSN40 投与群でさらに増強された。骨形成型オリゴ DNA である iSN40 は、インスリン依存的かつ TLR9 非依存的に軟骨分化を促進し、軟骨基質の産生を増強することが示唆されたことから、変形性関節症をはじめとする関節疾患に対する核酸医薬シーズとしての応用が期待される。

We have recently identified an osteogenetic oligodeoxynucleotide, iSN40 (5’-GGA ACG ATC CTC AAG CTT-3’), which promotes osteoblast differentiation in a TLR9-independent manner. Since both osteocytes and chondrocytes are derived from perichondrial progenitors, osteogenesis and chondrogenesis are thought to be intimately linked. In osteoarthritis, degradation of the articular cartilage matrix and development of osteophytes lead to inflammation and joint pain, resulting in gait disturbance and bedriddenness. Since stem stem cell-based regenerative medicine for articular cartilage is currently off-label, there is a need to develop molecules and methods to induce chondrogenesis. This study investigated the effect of iSN40 on the chondrogenic differentiation of the murine pre-chondrogenic cell line ATDC5.

Chondrogenic differentiation of ATDC5 was induced by 10 ug/ml insulin. 10 uM iSN40 or iSN40-GC was co-treated with insulin. iSN40-GC is generated by substitution of the TLR9-recognized CG sequence within iSN40 to GC and is known to induce osteoblast differentiation to the same extent as iSN40. After 8 days of differentiation, ATDC5 cells were stained with Sirius red for collagen and with Alcian blue for proteoglycan to quantify the cartilage matrix to evaluate chondrogenesis. The intensities of Sirius red and Alcian blue were significantly increased by insulin and further enhanced by co-treatment of iSN40 or iSN40-GC with insulin. In contrast, treatment with iSN40 alone did not affect chondrogenic differentiation. Quantitative PCR revealed that the expression levels of cartilage matrix, type 2 collagen (Col2a1) and aggrecan (Acan), were induced by insulin and further increased by iSN40 with insulin. These results demonstrate that an osateogenetic oligodeoxynucleotide, iSN40, induces chondrogenesis in an insulin-dependent and TLR9-independent manner, and enhances cartilage matrix production. iSN40 may be a nucleic acid drug candidate for arthropathy, including osteoarthritis.