抗ヌクレオリンアプタマー iSN04 は BMP2 による筋分化阻害を回復する

抗ヌクレオリンアプタマー iSN04 は BMP2 による筋分化阻害を回復する

石田智香, 高谷智英.

日本核酸医薬学会第9回年会 (仙台), 2024/07/16 (ポスター).

Abstract

18塩基の抗ヌクレオリンアプタマーである iSN04 (5’-AGA TTA GGG TGA GGG TGA-3’) は、筋分化を強力に促進し、骨分化を抑制するため、異所性骨化の治療に有用ではないかと考えた。骨ではない部位に骨形成が起こる異所性骨化は、過剰な骨形成タンパク質 (BMP) によって外傷や手術でも惹起される。骨格筋前駆細胞 (筋芽細胞) は、BMP の投与により筋分化が阻害され骨分化が誘導されることから、筋組織の異所性骨化モデルとして用いられる。本研究では、BMP2 を投与したマウス筋芽細胞株 C2C12 の筋分化および骨分化における iSN04 の作用を検討した。

C2C12 細胞に BMP2 および iSN04 を投与して筋分化を誘導した。48時間後に、骨格筋の最終分化マーカーであるミオシン重鎖 (MHC) の免疫染色で筋分化を評価した。BMP2 投与群では、MHC 陽性の筋細胞の割合が対照群と比較して有意に減少したが、この BMP2 依存的な筋分化阻害は iSN04 の投与で回復した。定量 PCR により、分化誘導24時間後には、筋原性転写因子 myogenin (Myog)、MHC (Myh3)、筋管形成に必須の膜タンパク質である myomaker (Tmem8c) および myomixer (Mymx) の発現量が、BMP2 投与で有意に減少し、iSN04 投与で回復することがわかった。同様に、筋分化を抑制する myostatin (Mstn) の発現量は、BMP2 で有意に増加し、iSN04 で減少する傾向にあった。次に、C2C12 に BMP2 と iSN04 を投与し、８日間分化誘導した。定量 PCR の結果、骨特異的な遺伝子の発現量が BMP2 投与群で増加し、iSN04 投与群で減少することがわかった。一方、iSN04 の標的であるヌクレオリンは C2C12 の細胞核に局在するが、BMP や iSN04 で刺激しても発現量や局在は変化しなかった。iSN04 によるヌクレオリン阻害は、BMP 依存的な筋分化阻害を回復して骨分化を抑制したことから、iSN04 は異所性骨化に対する核酸医薬品シーズとして期待される。

An 18-base anti-nucleolin aptamer, iSN04 (5’-AGA TTA GGG TGA GGG TGA-3’), potently promotes myogenic differentiation and inhibits bone differentiation. iSN04 is hypothesized to be useful in the treatment of heterotopic ossification, which is extraskeletal bone formation induced by excessive bone morphogenic proteins (BMPs), such as in trauma and surgery. BMP treatment of skeletal muscle progenitor cells (myoblasts) inhibits myogenic differentiation and results in abnormal bone differentiation, which is used as a model of ectopic ossification. This study investigated the effect of iSN04 on myogenic and bone differentiation of BMP2-treated murine myoblast cell line C2C12.

C2C12 cells treated with BMP2 and iSN04 were induced to differentiate. After 48 h, myogenic differentiation was quantified by immunostaining for myosin heavy chain (MHC), a terminal differentiation marker of skeletal muscle. In the BMP2-treated group, the ratio of MHC-positive myocytes was significantly decreased compared to the control group, but the BMP2-inhibited myogenesis was reversed by iSN04 treatment. Quantitative PCR after 24 h of differentiation revealed that BMP treatment significantly suppressed but iSN04 restored the expression levels of a myogenic regulatory factor, myogenin (Myog), MHC (Myh3), and membrane proteins required for myotube formation, myomaker (Tmem8c) and myomixer (Mymx). Similarly, the expression levels of a myogenesis inhibitor, myostatin (Mstn), were significantly increased by BMP and tended to be decreased by iSN04. In contrast, the expression and nuclear localization of nucleolin, the target of iSN04, were not altered by BMP and iSN04 stimulation. Since antagonizing nucleolin by iSN04 reverses myogenic differentiation and ectopic bone differentiation of BMP-treated myoblasts, iSN04 may be a nucleic acid drug candidate for heterotopic ossification.