SDS-PAGE

Introduction

SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis; ラウリル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミド電気泳動) は、SDS 化したタンパク質の電気泳動法である。

Materials

Protocol

Running ゲルの作成

  1. MQ で濡らしたゴム (スペーサー) をゲル板に挟み、クリップで固定する。MQ を入れて漏れないか確認する。
  2. Running ゲルを作成する (2枚分)。50 ml チューブに下記溶液を上から順に加える。
  3. 6% 8% 10% 12% 15% 18%
    MQ 8.0 ml 6.9 ml 6.0 ml 5.0 ml 3.5 ml 2.0 ml
    1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) 3.8 ml 3.8 ml 3.8 ml 3.8 ml 3.8 ml 3.8 ml
    10% SDS 150 ul 150 ul 150 ul 150 ul 150 ul 150 ul
    30% polyacrylamide 3.0 ml 4.1 ml 5.0 ml 6.0 ml 7.5 ml 9.0 ml
    10% APS 200 ul 200 ul 200 ul 200 ul 200 ul 200 ul
    TEMED 12 ul 9 ul 6 ul 6 ul 6 ul 6 ul
  4. TEMED を加えたら固まり出すので、よく撹拌する。
  5. 気泡が入らないように、クリップの目印までゲル板にゲルを流し込む。上端をコームの分だけ空ける。
  6. 1 ml のイソプロパノールをゲル板にゆっくりと流し込む。
  7. ゲルが固まるまで待つ (1 h~)。50 ml チューブに残ったゲル溶液でゲルが固まったかを判断する。
  8. 当日 SDS-PAGE をしない場合は、イソプロパノールを MQ に置換し、ラップをして 4°C 保存。

Stacking ゲルの作成

  1. Stacking ゲルを作成する (2枚分)。15 ml チューブに下記溶液を上から順に加える。
  2. 5%
    MQ 4.1 ml
    0.5 M Tris-HCl (pH 6.8) 750 ul
    10% SDS 60 ul
    30% polyacrylamide 1 ml
    10% APS 60 ul
    TEMED 6 ul
  3. イソプロパノール (MQ) を除去し、running ゲルの上に stacking ゲルをゲル板いっぱいに流し込む。
  4. MQ で濡らしたコームを、気泡が入らないように差し込む。
  5. ゲルが固まったらコームを外す。クリップを外し、ゲル板がズレないようにピンセットでゴムを外す。

電気泳動

  1. 泳動槽に running buffer を入れる。
  2. プラスチック枠にゲル板を固定し、気泡が入らないように泳動槽にセットする。
  3. Well が完全に浸されるように、ゲル板内部を running buffer で満たす。
  4. Protein ladder (10 ul) と SDS 化したタンパク質溶液をアプライする。
  5. 泳動槽にフタをし、電源とコードでつなぐ。
  6. ゲル1枚なら定電流 20 mA (2枚なら 40 mA)、最大電圧 200 V で泳動する。
  7. 泳動時間は、ゲル濃度や検出したいタンパク質の分子量によって異なる。
    30-60 分以降、こまめに確認して最適なタイミングで泳動を停止する。
  8. 泳動層からゲル板を取り出し、トレーなどで MQ に浸して乾燥を防ぐ。

CBB 染色や Western ブロッティングに進む。

References

Shinji S, Nakamura S, Nihashi Y, Umezawa K, Takaya T*. Berberine and palmatine inhibit the growth of human rhabdomyosarcoma cells. Biosci Biotechnol Biochem. 2020; 84: 63-75.

Shinji S, Umezawa K, Nihashi Y, Nakamura S, Shimosato T, Takaya T*. Identification of the myogenetic oligodeoxynucleotides (myoDNs) that promote differentiation of skeletal muscle myoblasts by targeting nucleolin. Front Cell Dev Biol. 2021; 8: 616706.