抗ヌクレオリンアプタマー iSN04 は Smad1/5 のリン酸化を阻害して BMP シグナルに干渉する

抗ヌクレオリンアプタマー iSN04 は Smad1/5 のリン酸化を阻害して BMP シグナルに干渉する

松島もも1, 石田智香1, 高谷智英1,2.

  1. 信州大学大学院総合理工学研究科.
  2. 信州大学大学農学部.

日本核酸医薬学会第10回年会 (神戸), 2025/07/02 (ポスター).

Abstract

本研究室で同定された抗ヌクレオリンアプタマー iSN04 (5’-AGA TTA GGG TGA GGG TGA-3’) は、骨格筋、心筋、平滑筋分化を促進する一方、脂肪分化を抑制する。さらに我々は、iSN04 が BMP2 依存的な骨芽細胞の分化を阻害することを見出したが、そのメカニズムは不明であった。BMP で刺激された骨芽細胞の BMP 受容体は、細胞質の Smad1/5/8 をリン酸化する。リン酸化 (p-) Smad1/5/8 は核内移行し、転写因子として骨遺伝子の発現を誘導することが知られている。そこで本研究では、iSN04 が Smad1/5 のリン酸化、核内移行、および転写活性に及ぼす影響を調べた。

マウス骨芽細胞株 MC3T3-E1 を 30 uM の iSN04 で３時間前処理した後、100 ng/ml の BMP2 で１時間刺激した。ウエスタンブロットの結果、p-Smad1/5 のタンパク質量は iSN04 を前処理した群で有意に減少することがわかった。同様に刺激した骨芽細胞を免疫染色した結果、BMP2 投与群で観察される p-Smad1/5 の核内移行は、iSN04 の前処理によって顕著に阻害されることがわかった。一方、骨形成に必須の転写因子 Runx2 の核内局在は、iSN04 による変化を認めなかった。

次に、Smad5 の転写活性を調べた。７個の Smad5 結合配列 (GTCTAGAC[T/G]) を含むプロモーター下でルシフェラーゼが発現するレポータープラスミドを骨芽細胞に導入した後、100 ng/ml の BMP2 と 30 uM の iSN04 を投与した。96時間後にルシフェラーゼアッセイを行った結果、BMP2 依存的に増加するルシフェラーゼ活性が iSN04 によって低下することがわかった。

以上の結果から、抗ヌクレオリンアプタマー iSN04 は、Smad1/5 のリン酸化、核内移行、および転写活性を阻害して BMP シグナルに干渉し、骨遺伝子の発現と骨分化を抑制することが示された。今後、ヌクレオリンと Smad1/5 の相互作用を調べることで、iSN04 による BMP シグナルの制御を確立したい。

The anti-nucleolin aptamer, iSN04 (5’-AGA TTA GGG TGA GGG TGA-3’), promotes skeletal, cardiac, and smooth muscle differentiation, while inhibiting adipose differentiation. We have also reported that iSN04 suppresses bone morphogenetic protein 2 (BMP2)-induced bone differentiation of osteoblasts, but the mechanism is still unclear. The BMP-bound BMP receptor on osteoblasts is known to phosphorylate Smad1/5/8 in the cytoplasm. Phosphorylated (p-) Smad1/5/8 translocates to the nucleus and serves as a transcription factor to induce osteogenic gene expression. This study investigated the effects of nucleolin antagonism by iSN04 on the phosphorylation, nuclear translocation, and transcriptional activity of Smad1/5.

Murine osteoblast cell line MC3T3-E1 was pre-treated with 30 uM iSN04 for 3 h and then stimulated with 100 ng/ml BMP2 for 1 h. Western blotting revealed that the protein level of p-Smad1/5 was significantly decreased by pre-treatment with iSN04. Immunostaining showed that the BMP2-induced nuclear translocation of p-Smad1/5 was almost completely inhibited by iSN04. However, iSN04 did not affect the nuclear localization of Runx2, a transcription factor essential for osteogenesis.

To study the transcriptional activity of Smad5, the reporter plasmid expressing luciferase under the promoter with seven Smad5-binding sequences (GTCTAGAC[T/G]) was introduced into osteoblasts. The cells were then treated with 100 ng/ml BMP2 and 30 uM iSN04 for 96 h. The dual luciferase assay showed that the BMP2-dependent increase in luciferase activity was decreased by iSN04.

These results demonstrated that the anti-nucleolin aptamer iSN04 interferes with BMP signaling by inhibiting the phosphorylation, nuclear translocation, and transcriptional activity of Smad1/5, resulting in the suppression of osteogenic gene expression and differentiation. Further investigation of the interaction between nucleolin and Smad1/5 will contribute to the regulation of BMP signaling by iSN04.