骨形成型オリゴ DNA による前駆細胞と間葉系幹細胞の骨・軟骨分化誘導

骨形成型オリゴ DNA による前駆細胞と間葉系幹細胞の骨・軟骨分化誘導

木村智勇1, 高谷智英1,2.

  1. 信州大学大学院総合理工学研究科.
  2. 信州大学大学農学部.

日本核酸医薬学会第10回年会 (神戸), 2025/07/02 (ポスター).

Abstract

iSN40 (5’-GGA ACG ATC CTC AAG CTT-3’) は、マウス骨芽細胞株 MC3T3-E1 の分化を TLR9 非依存的に促進する骨形成型オリゴ DNA として同定された。間葉系幹細胞 (MSC) は骨と軟骨の両方に分化するなど、両者は密接に関連している。変形性関節症は、関節軟骨の摩耗による痛みが運動障害をもたらす疾患で、幹細胞を用いた再生医療が期待される。我々は最近、iSN40 がマウス軟骨前駆細胞株 ATDC5 の分化を促進することを見出した。今後、iSN40 を骨や軟骨の再生医療に応用するには、その作用をヒト細胞で検証する必要がある。本研究では、ヒト MSC に対する iSN40 の作用を検討した。

ATDC5 に 10 ug/ml のインスリンと 10 uM の iSN40 を投与して軟骨分化を誘導し、８日後に染色および定量 PCR で軟骨分化を評価した。シリウスレッドおよびアルシアンブルーの染色強度は、インスリン投与群で有意に増加し、インスリン＋iSN40 投与群でさらに増加した。一方、iSN40 の単体投与は軟骨分化に影響しなかった。定量 PCR でも、軟骨基質である２型コラーゲンとアグリカンの発現量がインスリン投与群で増加し、インスリン＋iSN40 投与群でさらに増加した。また、iSN40 の TLR9 認識配列を置換した配列でも同様の結果を得たことから、iSN40 はインスリン依存的かつ TLR9 非依存的に軟骨分化を促進することがわかった。

次に、ヒト骨髄由来 MSC に 10-30 uM の iSN40 を投与して骨分化を誘導した。15日後にアリザリンレッド染色で分化した骨細胞の石灰化を評価した。その結果、10 および 30 uM の iSN40 を投与した群で、アリザリンレッドの染色強度が有意に増加し、iSN40 はヒト MSC の骨分化を促進することが示された。

以上の結果から、骨形成型オリゴ DNA である iSN40 は、軟骨・骨分化を促進し、変形性関節症や骨粗鬆症の治療に応用可能な核酸医薬シーズとして期待される。現在、ヒト MSC の軟骨細胞における iSN40 の作用を検討中である。

iSN40 (5’-GGA ACG ATC CTC AAG CTT-3’) is the osteogenetic oligodeoxynucleotide that promotes bone differentiation of the murine osteoblast cell line MC3T3-E1 in a Toll-like receptor 9 (TLR9)-independent manner. Osteogenesis and chondrogenesis are closely related, as mesenchymal stem cells (MSCs) can differentiate into both osteocytes and chondrocytes. Osteoarthritis is a joint disease characterized by inflammation and pain caused by cartilage wear, and stem cell-derived chondrocytes have been studied for regenerative medicine. We recently found that iSN40 facilitates the differentiation of the murine pre-chondrogenic cell line ATDC5. To apply iSN40 in bone and cartilage regeneration therapy, its action on human cells needs to be studied. This study investigated the effects of iSN40 on human bone marrow-derived MSCs.

ATDC5 cells were treated with 10 ug/ml insulin and 10 uM iSN40 for 8 days to induce chondrogenic differentiation. To quantify chondrogenesis, the cartilage matrix of the cells was stained with Sirius red for collagen or Alcian blue for proteoglycan. The signal intensities of Sirius red and Alcian blue were significantly increased by insulin and further enhanced by co-treatment with insulin and iSN40. In contrast, treatment with iSN40 alone did not affect chondrogenic differentiation. Quantitative PCR also revealed that the expression levels of cartilage matrix, type 2 collagen (Col2a1) and aggrecan (Acan), were induced by insulin and further increased by insulin with iSN40. Substitution of a TLR9 recognition site within iSN40 showed similar results, indicating that iSN40 promotes chondrogenic differentiation in an insulin-dependent and TLR9-independent manner.

Human bone marrow-derived MSCs were treated with 10-30 uM iSN40 for 15 days to induce osteogenic differentiation. The cells were then stained with Alizarin red to quantify osteocyte calcification. The signal intensity of Alizarin red was significantly increased by both 10 and 30 uM iSN40, indicating that iSN40 promotes osteogenesis of human MSCs.

These results demonstrate that the osteogenetic oligodeoxynucleotide, iSN40, which induces chondrogenic and osteogenic differentiation, may be a potential nucleic acid drug for the treatment of osteoarthritis and osteoporosis. We are currently investigating the effect of iSN40 on the chondrogenesis of human MSCs.