抗ヌクレオリンアプタマー iSN04 は BMP2-Smad1/5 シグナル伝達経路を阻害して異所性骨化を抑制する

抗ヌクレオリンアプタマー iSN04 は BMP2-Smad1/5 シグナル伝達経路を阻害して異所性骨化を抑制する

石田智香1, 松島もも1, 高谷智英1,2.

  1. 信州大学大学院総合理工学研究科.
  2. 信州大学大学農学部.

日本核酸医薬学会第10回年会 (神戸), 2025/07/02 (ポスター).

Abstract

軟部組織に骨が形成される異所性骨化は、過剰な骨形成タンパク質 (BMP) シグナルによって生じる、外傷や手術の合併症である。我々が同定した抗ヌクレオリンアプタマー iSN04 (5’-AGA TTA GGG TGA GGG TGA-3’) は、筋分化を促進して骨分化を抑制するため、異所性骨化治療への応用が期待される。先行研究で、iSN04 は、マウス筋芽細胞株 C2C12 の BMP2 依存的な筋分化阻害を回復して骨分化を抑制することがわかったが、その作用機序は不明な点が多い。そこで本研究では、BMP2 で刺激した C2C12 細胞における Smad1/5 のリン酸化と核内移行に iSN04 が及ぼす影響を調べた。

C2C12 細胞を 10 uM の iSN04 で３時間前処理した後、100 ng/ml の BMP2 で１時間刺激した。ウェスタンブロットの結果、BMP2 刺激で有意に増加するリン酸化 (p-) Smad1/5 のタンパク質量は、iSN04 の前処理によって有意に減少することがわかった。同様に刺激した筋芽細胞を免疫染色した結果、BMP2 投与群で観察される p-Smad1/5 の核内移行は、iSN04 の前処理によって阻害されることがわかった。このことから、iSN04 によるヌクレオリン阻害は、BMP2 依存的な Smad1/5 のリン酸化と核内移行に干渉することで BMP シグナルをブロックし、筋遺伝子の発現を回復させ、骨遺伝子の転写を抑制することが示唆された。

次に、７個の Smad5 結合配列 (GTCTAGAC[T/G]) を含むプロモーター下でルシフェラーゼが発現するレポータープラスミドを C2C12 細胞に導入した後、100 ng/ml の BMP2 と 10 uM の iSN04 を投与した。４日後にルシフェラーゼ解析を行った結果、統計的に有意ではなかったが、ルシフェラーゼ活性が BMP2 投与で増加して iSN04 投与で減少する傾向を認めた。

以上の結果から、抗ヌクレオリンアプタマー iSN04 は、BMP2-Smad1/5 シグナル伝達経路を阻害することで、筋芽細胞の異所性骨化を抑制すると考えられる。

Heterotopic ossification is ectopic bone formation in soft tissues, a complication of trauma and burns, and induced by excessive bone morphogenetic protein (BMP) signaling. The anti-nucleolin aptamer, iSN04 (5’-AGA TTA GGG TGA GGG TGA-3’), which promotes myogenesis and inhibits osteogenesis, is a nucleic acid drug candidate for the prevention and therapy of heterotopic ossification. We have previously shown that iSN04 restores myogenesis and inhibits ectopic bone differentiation of the BMP2-treated murine myoblast cell line C2C12, but the mechanism is not fully understood. This study investigated the effects of nucleolin antagonism by iSN04 on the phosphorylation, nuclear translocation, and transcriptional activity of Smad1/5, which is a downstream of BMP receptors, in the BMP2-treated C2C12 cells.

C2C12 cells were pre-treated with 10 uM iSN04 for 3 h and then stimulated with 100 ng/ml BMP2 for 1 h. Western blotting revealed that the protein level of phosphorylated (p-) Smad1/5 was significantly increased in the BMP2-treated group and significantly decreased in the iSN04/BMP2-treated group. Immunostaining showed that the BMP2-induced nuclear translocation of p-Smad1/5 was attenuated by the pre-treatment with iSN04. These results suggest that nucleolin antagonism by iSN04 blocks BMP signaling by interfering with BMP2-dependent phosphorylation and nuclear translocation of Smad1/5, resulting in the revesal of myogenic gene expression and suppression of osteogenic transcriptions.

To investigate the effects of BMP2 and iSN04 on Smad5 transcriptional activity in myoblasts, the reporter plasmid expressing firefly luciferase under the promoter with seven Smad5-binding sites (GTCTAGAC[T/G]) was transfected into C2C12 cells. The cells were then treated with 100 ng/ml BMP2 and 10 uM iSN04 for 4 days and subjected to dual luciferase assay. Although there were no significant differences, luciferase activity was increased by BMP2 and decreased by pre-treatment with iSN04.

These data demonstrate that the anti-nucleolin aptamer iSN04 interferes with the BMP2-Smad1/5 signaling axis and suppresses heterotopic ossification of myoblasts.