分子細胞機能学研究室

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抗ヌクレオリンアプタマー iSN04 は異種移植マウスにおける胎児型横紋筋肉腫の増殖を抑制する

高谷智英, 山本万智.

• 信州大学大学院総合理工学研究科.

日本核酸医薬学会第9回年会 (仙台), 2024/07/16 (ポスター).

Abstract

18塩基の抗ヌクレオリンアプタマーである iSN04 (5’-AGA TTA GGG TGA GGG TGA-3’) は、筋分化を強力に促進し、骨格筋を発生母地とする横紋筋肉腫の増殖を抑制する。横紋筋肉腫は小児で最も多い軟部悪性腫瘍だが、超大量化学療法を受ける高リスク患者の５年生存率は約 30% である。本研究では、横紋筋肉腫に有効なアプタマー医薬品の開発を目的に、ヌードマウスに移植したヒト胎児型横紋筋肉腫細胞株 RD の増殖に対する iSN04 の効果を検討した。

ホスホロチオエート化オリゴ DNA である iSN04は、株式会社ナティアスにより、同社が東レエンジニアリングと共同で開発した Molecutideser^® を使用して合成された。ナティアス製 iSN04 は、従来法で合成された iSN04 と同程度に RD 細胞の増殖を in vitro で抑制したことから、以下の動物試験を行った。横紋筋肉腫のモデルとして、６週齢の雌マウス (BALB/cSlc-nu/nu) の体幹皮下に 1.0×10⁷ 個の RD 細胞を移植し、２週間、腫瘍を形成させた。その後、PBS に溶解した iSN04 (1 mg/100 ul) を腫瘍近傍 5 mm の皮下に週３回×３週間、注射した (n = 7)。対照群には同量の PBS を投与した (n = 5)。体表から計測した推定腫瘍体積は、iSN04 投与１週間後から、PBS群と比較して iSN04群で有意に減少した。また、試験後に摘出した腫瘍の重量も、PBS群 (33.1±4.2 mg) に比べてiSN04群 (8.1±1.6 mg) で有意に減少していた。一方、試験期間を通じて、両群で体重の差はなかった。また、解剖時の肉眼的所見でも臓器異常は見られなかった。腫瘍の凍結切片をヘマトキシリン-エオシン染色した結果、PBS群では腫瘍細胞に特徴的な核の肥大化や形態不整が観察されたが、iSN04群では核の小型化と細胞質の減少を認め、iSN04 が RD 細胞の形質転換を誘導したことが示唆された。iSN04 は生体内でも抗横紋筋肉腫作用を示したことから、今後、ヌクレオリンを標的としたアプタマー医薬品としての応用が期待される。

An 18-base anti-nucleolin aptamer, iSN04 (5’-AGA TTA GGG TGA GGG TGA-3’), potently promotes myogenic differentiation and inhibits the growth of rhabdomyosarcoma (RMS), a tumor that arises in skeletal muscle. RMS is the most frequent soft tissue tumor in children, but the five-year survival rate for high-risk patients treated with high-dose chemotherapy is ~30%. To develop the aptamer drug for RMS, this study investigated the effect of iSN04 on the growth of human embryonal RMS cell line RD in xenograft nude mice.

iSN04, a phosphorothioate oligodeoxynucleotide, was synthesized by NATiAS Inc. using Molecutideser^® developed by NATiAS Inc. and Toray Engineering Co., Ltd. Since NATiAS-iSN04 inhibited the growth of RD cells in vitro to the same extent as conventional iSN04, it was used for the following animal experiment. 1.0×10⁷ RD cells were injected subcutaneously into the flank of 6-week-old female mice (BALB/cSlc-nu/nu). After 2 weeks of tumor formation, iSN04 dissolved in PBS (1 mg/100 ul) was administered subcutaneously at 5 mm distance from the tumors 3 times per week for 3 weeks (n = 7). The equal volume of PBS was injected as a negative control (n = 5). Tumor volumes estimated from body surface area were significantly smaller in the iSN04 group than in the PBS group starting one week after iSN04 treatment. Tumor weights measured at the endpoint were also significantly lower in the iSN04 group (8.1±1.6 mg) than in the PBS group (33.1±4.2 mg). On the other hand, body weights were not different between the two groups throughout the experiment, and there were no gross abnormalities in dissection. Hematoxylin-eosin staining of frozen sections of tumors revealed that the PBS group showed abnormal hypertrophy and irregular morphology of nuclei as characteristics of tumor cells, but the iSN04 group showed smaller nuclei and cytoplasm, suggesting that iSN04 induced transformation of RD cells. These results demonstrate that iSN04 exerts anti-RMS effect in vivo, and it may be the nucleolin-targeting aptamer drug for clinical application.