Introduction
BCA 法は、タンパク質溶液の濃度を比色定量する測定法である。タンパク質のペプチド結合によって、Cu2+ が Cu+ に還元される。Cu+ が BCA (bicinchoninic acid; ビシンコニン酸) に配位すると、562 nm の波長を吸収する青紫色の錯体を形成する。濃度がわかっている標準 BSA 溶液の吸光度から検量線を求め、測定したサンプルのタンパク質濃度を計算する。
Materials
- BCA protein assay kit (TaKaRa, T9300A), 4°C
- 標準 BSA 溶液 (0-2000 ug/ul), 4°C
- 96-well plate
Protocol
BCA 反応
- BCA reagent A と B を 100: 1 で混合する (50 ul/sample)。
- 50 ul/well の混合した BCA reagent を 96-well plate に加える。
- 5 ul/well の BSA およびサンプル溶液を加え、ピペッティングする。
- インキュベーション, 37°C, 30 min。
タンパク質濃度が高い well が青紫色になる。サンプルの発色を見て時間を調節する。
微量分光光度計による濃度測定
- 微量分光光度計 (タンパク質用) の電源を入れる。
- サンプルをアプライするプラスチックプレートを確認し、汚れ・傷などがあれば交換する。
- 「1. Start Measurement」を選択する。
- 「BCA Assay (562 nm)」を選択する。
- 注意が表示されるので次に進む。
- 「Blank」を選択する。
- 0 ug/ul の BSA 溶液 2 ul を測定部位にアプライし、↵ を押して測定する。
- Blank が測定できたら、ペーパーワイプで測定部位を拭き取る。
- 31.25 ug/ul の BSA 溶液 2 ul をアプライする。
- 「Samples (BCA)」を選択して測定する。
- ペーパーワイプで測定部位を拭き取る。
- BSA 溶液とサンプルの数だけ、9〜11 を繰り返す。
- 測定が終了したら、「Save & Exit」、「Save」の順に選択する。
- 「2. Show & Print Results」を選択する。
- 保存したデータ「Data_0X YYMMDD HHMM RNA」を選択する。
- 「Select All」を選択する。全てのサンプルにチェックマークが付く。
- 「Print」を選択すると印刷が始まる。
印刷されたシートに、BSA 溶液やサンプル名などを記入し、実験ノートに貼付する。 - 「Data Menu」、「Exit to Main Menu」の順に選択する。
- メインメニューの画面で電源ボタンを押し、「Yes」を選択して電源を切る。
検量線の作成と濃度計算
下記 Excel ファイルを用いて検量線の作成と濃度計算を行う。
- 各 BSA 溶液の吸光度を入力する。
- グラフに検量線が引かれ、検量線の方程式が表示される。
- 方程式の傾きと切片を入力する。
- サンプル名を入力し、各サンプルの吸光度を入力する。
- 計算された各サンプルのタンパク質濃度が表示される。
- 計算結果を印刷し、実験ノートに貼付する。