分子細胞機能学研究室

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Materials

• PBS(-)
• Lysis buffer, 4°C
• Protease inhibitor cocktail, x100 (ナカライ, 23955-24), -20°C
• セルスクレーパー (TrueLine, TR9000)

Protocol: 6 cm dish の場合

氷を準備する。遠心機を冷却しておく。
必要量の lysisu buffer に、1/100 量の protease inhibitor cocktail を加える。

1. 1 ml の PBS(-) で wash, 2回。
2. 1 ml の PBS(-) を加え、セルスクレーパーで細胞を回収し、1.5 ml チューブに移す。
3. 遠心, 5000 rpm, 4°C, 1 min。
4. 沈殿した細胞を吸わないように、ピペットで上清を除去する。
5. 50 ul の lysis buffer を加え、ピペッティングして細胞を溶解する。
   細胞が溶解すると、溶出したタンパク質で lysis buffer が濁る。
6. 遠心, 12000 rpm, 4°C, 3 min。
   不溶性画分 (疎水性タンパク質、膜脂質など) を沈殿させる。
7. 上清 (可溶性タンパク質溶液9 を新しい 1.5 ml チューブに移す。
8. タンパク質の濃度を測定する。
9. 必要であれば、SDS 化などの調整をする。
10. -80°C 保存。

トラブルシューティング

目的のタンパク質が上手く回収できない場合、以下のことを試す価値がある。

• p53: PBS(-) で細胞を回収 → 遠心 → lysis buffer で溶解、ではなく、ディッシュに接着した状態の細胞に直接 lysis buffer を加えて溶解する。この場合、lysis buffer を可能な限り少量にしないと、タンパク質溶液の濃度が低くなる。

References