Materials
- PBS(-)
- Lysis buffer, 4°C
- Protease inhibitor cocktail, x100 (ナカライ, 23955-24), -20°C
- セルスクレーパー (TrueLine, TR9000)
Protocol: 6 cm dish の場合
氷を準備する。遠心機を冷却しておく。
必要量の lysisu buffer に、1/100 量の protease inhibitor cocktail を加える。
- 1 ml の PBS(-) で wash, 2回。
- 1 ml の PBS(-) を加え、セルスクレーパーで細胞を回収し、1.5 ml チューブに移す。
- 遠心, 5000 rpm, 4°C, 1 min。
- 沈殿した細胞を吸わないように、ピペットで上清を除去する。
- 50 ul の lysis buffer を加え、ピペッティングして細胞を溶解する。
細胞が溶解すると、溶出したタンパク質で lysis buffer が濁る。 - 遠心, 12000 rpm, 4°C, 3 min。
不溶性画分 (疎水性タンパク質、膜脂質など) を沈殿させる。 - 上清 (可溶性タンパク質溶液9 を新しい 1.5 ml チューブに移す。
- タンパク質の濃度を測定する。
- 必要であれば、SDS 化などの調整をする。
- -80°C 保存。
トラブルシューティング
目的のタンパク質が上手く回収できない場合、以下のことを試す価値がある。
- p53: PBS(-) で細胞を回収 → 遠心 → lysis buffer で溶解、ではなく、ディッシュに接着した状態の細胞に直接 lysis buffer を加えて溶解する。この場合、lysis buffer を可能な限り少量にしないと、タンパク質溶液の濃度が低くなる。
References
Shinji S, Nakamura S, Nihashi Y, Umezawa K, Takaya T*. Berberine and palmatine inhibit the growth of human rhabdomyosarcoma cells. Biosci Biotechnol Biochem. 2020; 84: 63-75.