分子細胞機能学研究室

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Materials

• PBS(-) or TBS
• Lysis buffer (+1% NP-40), 4°C
• RIPA buffer (ナカライ, 16488-34), 4°C
• Protease inhibitor cocktail, x100 (ナカライ, 23955-24), -20°C
• セルスクレーパー (TrueLine, TR9000)

Protocol: 6 cm dish の場合

氷を準備する。遠心機を冷却しておく。
必要量の lysisu buffer (+1% NP-40) もしくは RIPA buffer に、1/100 量の protease inhibitor cocktail を加える。
リン酸化タンパク質を検出したい場合は、PBS(-) ではなく TBS を使う。

1. 1 ml の PBS(-) で wash, 2回。
2. 1 ml の PBS(-) を加え、セルスクレーパーで細胞を回収し、1.5 ml チューブに移す。
3. 遠心, 5000 rpm, 4°C, 1 min。
4. 沈殿した細胞を吸わないように、ピペットで上清を除去する。
5. 50 ul の lysis/RIPA buffer を加え、ピペッティングして細胞を溶解する。
   細胞が溶解すると、溶出したタンパク質で lysis/RIPA buffer が濁る。
6. 遠心, 12000 rpm, 4°C, 3 min。
   不溶性画分 (疎水性タンパク質、膜脂質など) を沈殿させる。
7. 上清 (可溶性タンパク質溶液) を新しい 1.5 ml チューブに移す。
8. タンパク質の濃度を測定する。
9. 必要であれば、SDS 化などの調整をする。
10. -80°C 保存。

トラブルシューティング

目的のタンパク質が上手く回収できない場合、以下のことを試す価値がある。

• Lysis buffer と比べ、RIPA buffer は細胞を溶解する力が強く、タンパク質の収量も増えやすい。その分、タンパク質を変性させる力も強い。Western ブロッティングをするだけなら RIPA buffer で良いが、結合タンパク質を調べる実験など、タンパク質の構造をできるだけ保ちたい場合は lysis buffer を使う。

References