分子細胞機能学研究室

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Materials

• 同性のマウス２匹 (兄弟姉妹が望ましい) (４週齢以降のできるだけ若い個体が良い)
• PBS(-), 4°C
• DMEM/10% FBS/PS, 4°C
• Collagenase II 溶液 (2 mg/ml collagenase II [SIGMA, C6885] in DMEM/10% FBS/PS), -20°C
• mMB-GM (Ham's F-10/20% FBS/bFGF/PS), 4°C
• Amphotericin B [Fungizone] (×100, 250 ug/ml) (Wako, 019-23891), -20°C
• 解剖用具
• 10 cm ペトリディッシュ
• 6 cm ガラスディッシュ (オートクレーブ滅菌)
• 10 ml シリンジ (テルモ, SS-10ESZP)
• 18 G 注射針 (テルモ, NN-1838R)
• 100 um セルストレーナー (アズワン, VCS-100)
• 10 cm dish (non-coat)
• 10 cm コラーゲンディッシュ

Protocol

Day 1

1. 10 cm ペトリディッシュに 20 ml の PBS(-) を入れる。
2. 6 cm ガラスディッシュに 10 ml の collagenase II 溶液を入れる。
3. マウスを頚椎脱臼で安楽死させる。
4. マウスに消毒用 EtOH を噴霧する。
   摘出する骨格筋組織に毛が張り付かないよう、全身を充分に湿らせる。
5. 腹の皮膚にハサミで切り込みを入れ、ピンセットで皮膚を剥ぎ、全身の筋肉を露出させる。
6. 骨格筋 (下腿筋・大腿筋・腹筋・上腕筋) を摘出して PBS(-) に浸す。
7. 骨格筋を PBS(-) で軽く洗う。
8. 骨格筋に付着している脂肪・腱・血管を取り除く。
9. 骨格筋を collagenase II 溶液に入れる。
10. 以下の作業は安全キャビネット内で行う。
11. 骨格筋を先端カーブのハサミでミンスする。
ミンスの度合いが筋芽細胞の採取効率を決める。充分にミンスする。
12. CO₂ インキュベーション, 37°C, 1 hr。
13. 18 G の針を装着した 10 ml シリンジで骨格筋を懸濁する。
    注射針を通らない大きな肉片はハサミでミンスする。
14. CO₂ インキュベーション, 37°C, 15 min。
15. 18 G の針を装着した 10 ml シリンジで骨格筋を懸濁する。
16. 50 ml チューブに 25 ml の DMEM/10% FBS/PS を入れる。
17. 骨格筋の懸濁液を上記の DMEM/10% FBS/PS に加える。
18. 別の 50 ml チューブにセルストレーナーを装着する。
19. 骨格筋の懸濁液をセルストレーナーで濾過する。
20. 遠心, 1500 rpm, RT, 3 min。
21. アスピレーターで上清を除去する。
22. 沈殿した細胞を 21 ml の mMB-GM で懸濁する。
23. 210 ul (1/100 量, 終濃度 2.5 ug/ml) の amphotericin B を加える。
24. 10 cm dish (non-coat) ３枚 (7 ml/dish) に播種する。
25. CO₂ インキュベーション, 37°C, O/N。

Day 2

1. 前日播種した 10 cm dish (non-coat) ３枚の上清をまとめて 50 ml チューブに回収する。
   10 cm dish (non-coat) には線維芽細胞が接着している。上清は筋芽細胞、血球、死細胞を含む。
2. 遠心, 1500 rpm, RT, 3 min。
3. アスピレーターで上清を除去する。
4. 沈殿した細胞を 8 ml の mMB-GM で懸濁する。
5. 80 ul の amphotericin B を加える。
6. 10 cm コラーゲンディッシュ１枚に播種する。
7. CO₂ インキュベーション, 37°C, O/N。

References