分子細胞機能学研究室

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ニワトリ有精卵の孵卵

Materials

• ニワトリ有精卵, 4°C (１セット10個が目安)
  産卵後２週間を過ぎると孵化率が落ちる。産卵後5日以内の入卵が好ましい。
• 孵卵器
• バット
• MQ

Protocol

孵卵器をエタノールで掃除する。冬季は、器内温度・湿度を一定にさせるために、電源を入れてから半日ほど試運転する。有精卵に入卵日や番号を書いておく。

1. 試運転している場合は、孵卵器の電源を一度落とす。
2. バットに MQ を入れ、孵卵器内に置く。
3. 孵卵器から卵設置台を出し、卵設置台に有精卵を横向きに置く。
   転卵時に接触しないよう、卵を一列に詰めすぎないようにする。
4. 卵設置台を孵卵器に戻す。黒いゴムが付いた側を手前にする。
5. 卵設置台の横 (孵卵器の内側) の金具で、転卵角度を「大」(外側の穴。１回の転卵角度が90度) に設定する。
6. 孵卵器の扉を閉め、電源ケーブルをコンセントに差し込む。
7. 孵卵器の電源 (孵卵器上側のスイッチ) を入れ、器内温度を 37°C に設定する。
8. 孵卵器右側のダイアルで転卵時間を15分に設定し、スイッチを「自動」にして転卵を開始する。
   15分後に設定通りに転卵するのを確認する。
9. 孵卵器の温度・湿度を維持したまま10日間培養する。

孵卵器は毎日確認し、バットの MQ は２～３日ごとに交換する。孵化作業を始めたら、孵卵器の電源は切らない。

ニワトリ筋芽細胞の採取・培養

Materials

• ニワトリ10日胚 (１セット10匹が目安)
• PBS(-), 4°C
• DMEM/10% FBS/PS, 4°C
• Collagenase II 溶液 (2 mg/ml collagenase II [SIGMA, C6885] in DMEM/10% FBS/PS), -20°C
• chMB-GM (RPMI 1640/20% FBS/NEAA/CEE/bFGF/PS), 4°C
• Amphotericin B [Fungizone] (×100, 250 ug/ml) (Wako, 019-23891), -20°C
• 解剖用具
• 10 cm ペトリディッシュ
• 6 cm ガラスディッシュ (オートクレーブ滅菌)
• 10 ml シリンジ (テルモ, SS-10ESZP)
• 18 G 注射針 (テルモ, NN-1838R)
• 100 um セルストレーナー (アズワン, VCS-100)
• 10 cm dish (non-coat)
• 10 cm コラーゲンディッシュ

Protocol: Day 1

1. 10 cm ペトリディッシュに 20 ml の PBS(-) を入れる。
2. 6 cm ガラスディッシュに 10 ml の collagenase II 溶液を入れる。
3. 孵卵した有精卵を割り、10日胚を取り出す。
4. 後肢を付け根から切断して PBS に浸す。
5. 骨格筋を collagenase II 溶液に入れる。
   このとき、皮膚や骨をできるだけ除去するが、非常に柔らかく分離が困難であるため、骨格筋の収量を第一に、ある程度の皮膚・骨の混入は許容する。
6. 以下の作業は安全キャビネット内で行う。
7. 骨格筋を先端カーブのハサミでミンスする。
ミンスの度合いが筋芽細胞の採取効率を決める。充分にミンスする。
8. CO₂ インキュベーション, 37°C, 1 hr。
9. 18 G の針を装着した 10 ml シリンジで骨格筋を懸濁する。
   注射針を通らない大きな肉片はハサミでミンスする。
10. CO₂ インキュベーション, 37°C, 15 min。
11. 18 G の針を装着した 10 ml シリンジで骨格筋を懸濁する。
12. 50 ml チューブに 25 ml の DMEM/10% FBS/PS を入れる。
13. 骨格筋の懸濁液を上記の DMEM/10% FBS/PS に加える。
14. 別の 50 ml チューブにセルストレーナーを装着する。
15. 骨格筋の懸濁液をセルストレーナーで濾過する。
16. 遠心, 1500 rpm, RT, 3 min。
17. アスピレーターで上清を除去する。
18. 沈殿した細胞を 21 ml の chMB-GM で懸濁する。
19. 210 ul (1/100 量, 終濃度 2.5 ug/ml) の amphotericin B を加える。
20. 10 cm dish (non-coat) ３枚 (7 ml/dish) に播種する。
21. CO₂ インキュベーション, 37°C, O/N。

Protocol: Day 2

1. 前日播種した 10 cm dish (non-coat) ３枚の上清をまとめて 50 ml チューブに回収する。
   10 cm dish (non-coat) には線維芽細胞が接着している。上清は筋芽細胞、血球、死細胞を含む。
2. 遠心, 1500 rpm, RT, 3 min。
3. アスピレーターで上清を除去する。
4. 沈殿した細胞を 8 ml の chMB-GM で懸濁する。
5. 80 ul の amphotericin B を加える。
6. 10 cm コラーゲンディッシュ１枚に播種する。
7. CO₂ インキュベーション, 37°C, O/N。

References