免疫染色: 96-well plate

Materials

Protocol

Day 1

  1. 約 20 ul の培地を残すようにして、培地を捨てる。
    実験中、細胞を絶対に乾燥させない!
  2. 200 ul の PBS(-) で wash, 2回。
  3. 100 ul の PFA を加えて固定する。RT, 5 min。
  4. 200 ul の 0.01% Triton で wash, 2回。
  5. 100 ul の 0.2% Triton を加えて透過処理 (細胞膜に孔を開ける)。RT, 5 min。
  6. 200 ul の 0.01% Triton で wash, 1回。
  7. 50 ul の 1% BSA を加えてブロッキング。RT, 30 min。
  8. 一次抗体を 1% BSA で希釈する。
    @MHC(MF20) 96-well plate 1枚分: @MHC(MH20) 6 ul + 1% BSA 6 ml (1/1000)
  9. 7. で加えた 1% BSA を捨て、50 ul の一次抗体希釈液を加える。
  10. インキュベーション, 4°C, O/N。

Day 2

  1. 二次抗体を 1% BSA で希釈する。
    @IgG 96-well plate 1枚分: @IgG 6 ul + 1% BSA 6 ml (1/1000)
  2. 200 ul の 0.01% Triton で wash, 2回。
  3. 50 ul の二次抗体希釈液を加える。
  4. Plate をアルミホイルで遮光してインキュベーション, RT, 1 hr。
  5. 200 ul の 0.01% Triton で wash, 2回。
  6. 50 ul の DAPI を加える。
  7. インキュベーション, RT, 5 min。
  8. DAPI を除去し、50 ul の PBS(-) を加える。
  9. 顕微鏡で観察・撮影する。