分子細胞機能学研究室

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Materials

• PBS(-), 染色用, RT
• 0.01% Triton in PBS(-), 4°C
• 0.2% Triton in PBS(-), 4°C
• 2% PFA in PBS(-), 4°C
• 1% BSA in PBS(-), 4°C
• DAPI in PBS(-) (1 ug/ml), 4°C
• 一次抗体, 4°C or -20°C
• 二次抗体, 4°C

Protocol

Day 1

1. 約 20 ul の培地を残すようにして、培地を捨てる。
   実験中、細胞を絶対に乾燥させない！
2. 200 ul の PBS(-) で wash, 2回。
3. 100 ul の PFA を加えて固定する。RT, 5 min。
4. 200 ul の 0.01% Triton で wash, 2回。
5. 100 ul の 0.2% Triton を加えて透過処理 (細胞膜に孔を開ける)。RT, 5 min。
6. 200 ul の 0.01% Triton で wash, 1回。
7. 50 ul の 1% BSA を加えてブロッキング。RT, 30 min。
8. 一次抗体を 1% BSA で希釈する。
   @MHC(MF20) 96-well plate １枚分: @MHC(MH20) 6 ul + 1% BSA 6 ml (1/1000)
9. 7. で加えた 1% BSA を捨て、50 ul の一次抗体希釈液を加える。
10. インキュベーション, 4°C, O/N。

Day 2

1. 二次抗体を 1% BSA で希釈する。
   @IgG 96-well plate １枚分: @IgG 6 ul + 1% BSA 6 ml (1/1000)
2. 200 ul の 0.01% Triton で wash, 2回。
3. 50 ul の二次抗体希釈液を加える。
4. Plate をアルミホイルで遮光してインキュベーション, RT, 1 hr。
5. 200 ul の 0.01% Triton で wash, 2回。
6. 50 ul の DAPI を加える。
7. インキュベーション, RT, 5 min。
8. DAPI を除去し、50 ul の PBS(-) を加える。
9. 顕微鏡で観察・撮影する。

References