分子細胞機能学研究室

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Introduction

SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis; ラウリル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミド電気泳動) は、SDS 化したタンパク質の電気泳動法である。

Materials

• 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8), RT
• 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8), RT
• 10% SDS, RT
• 30% polyacrylamide (ナカライ, 06141-35), 4°C
• 10% APS (ammonium peroxodisulfate), 4°C (stock -20°C)
• TEMED (N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine) (ナカライ, 33401-72), RT
• SDS-PAGE 用 running buffer, RT
• Protein ladder (ナカライ, 19593-25), -20°C

Protocol

Running ゲルの作成

1. MQ で濡らしたゴム (スペーサー) をゲル板に挟み、クリップで固定する。MQ を入れて漏れないか確認する。
2. Running ゲルを作成する (２枚分)。50 ml チューブに下記溶液を上から順に加える。

	6%	8%	10%	12%	15%	18%
MQ	8.0 ml	6.9 ml	6.0 ml	5.0 ml	3.5 ml	2.0 ml
1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)	3.8 ml	3.8 ml	3.8 ml	3.8 ml	3.8 ml	3.8 ml
10% SDS	150 ul	150 ul	150 ul	150 ul	150 ul	150 ul
30% polyacrylamide	3.0 ml	4.1 ml	5.0 ml	6.0 ml	7.5 ml	9.0 ml
10% APS	200 ul	200 ul	200 ul	200 ul	200 ul	200 ul
TEMED	12 ul	9 ul	6 ul	6 ul	6 ul	6 ul

3. TEMED を加えたら固まり出すので、よく撹拌する。
4. 気泡が入らないように、クリップの目印までゲル板にゲルを流し込む。上端をコームの分だけ空ける。
5. 1 ml のイソプロパノールをゲル板にゆっくりと流し込む。
6. ゲルが固まるまで待つ (1 h～)。50 ml チューブに残ったゲル溶液でゲルが固まったかを判断する。
7. 当日 SDS-PAGE をしない場合は、イソプロパノールを MQ に置換し、ラップをして 4°C 保存。

Stacking ゲルの作成

1. Stacking ゲルを作成する (２枚分)。15 ml チューブに下記溶液を上から順に加える。

	5%
MQ	4.1 ml
0.5 M Tris-HCl (pH 6.8)	750 ul
10% SDS	60 ul
30% polyacrylamide	1 ml
10% APS	60 ul
TEMED	6 ul

2. イソプロパノール (MQ) を除去し、running ゲルの上に stacking ゲルをゲル板いっぱいに流し込む。
3. MQ で濡らしたコームを、気泡が入らないように差し込む。
4. ゲルが固まったらコームを外す。クリップを外し、ゲル板がズレないようにピンセットでゴムを外す。

電気泳動

1. 泳動槽に running buffer を入れる。
2. プラスチック枠にゲル板を固定し、気泡が入らないように泳動槽にセットする。
3. Well が完全に浸されるように、ゲル板内部を running buffer で満たす。
4. Protein ladder (5 ul) と SDS 化したタンパク質溶液をアプライする。
5. 泳動槽にフタをし、電源とコードでつなぐ。
6. ゲル１枚なら定電流 20 mA (２枚なら 40 mA)、最大電圧 200 V で泳動する。
7. 泳動時間は、ゲル濃度や検出したいタンパク質の分子量によって異なる。
   30-60 分以降、こまめに確認して最適なタイミングで泳動を停止する。
8. 泳動層からゲル板を取り出し、トレーなどで MQ に浸して乾燥を防ぐ。

CBB 染色や Western ブロッティングに進む。

References