NucleoSpin による RNA の抽出

注意事項

NucleoSpin RNA Plus による RNA の抽出は、Trizol で抽出する場合と比較し、より純度の高い RNA が精製できるが、回収効率は落ちる。RNA-seq など RNA のクオリティが要求される実験には NucleoSpin を用いる。また、オリゴ DNA を投与した細胞にも NucleoSpin を用いる。これらに該当せず、かつ細胞数が少ない場合は Trizol を用いる (細胞数が多い場合はどちらでも良い)。

Plotocol: 接着培養した細胞の場合

  1. PBS(-) で wash, 2回。
  2. 350 ul の LBP を加えて細胞を溶解する。
    RT, 2-3 min 静置で細胞が溶解する。ES 細胞など多数の細胞が密集している場合はピペッティングでの溶解が必要。
  3. gDNA カラム (黄リング, ゲノム除去用) をコレクションチューブ (2 ml, フタなし) にセットする。
  4. 2 の細胞溶解液を gDNA カラム に加える。遠心, 11000 g, 4°C, 1 min。
    ゲノム DNA は gDNA カラム に吸着し、RNA はろ液としてコレクションチューブに落ちる。
  5. gDNA カラムを廃棄する。
  6. 100 ul の BS をろ液 (RNA) に加え、ピペッティングで混合する。
  7. RNA カラム (青リング, RNA 吸着用) を新しいコレクションチューブ (2 ml, フタなし) にセットする。
  8. 7 の溶液を RNA カラムに加え、溶液が完全に落ちるまで待つ。
    10 min ほど待っても落ちない場合は次のステップに移る。
    カラムに空気が含まれると上手く落ちないので、溶液を入れる際に気泡が入らないように注意する。
  9. 遠心, 11000 g, 4°C, 1 min。
    RNA は RNA カラムに吸着し、ろ液には含まれない。
  10. ろ液を捨て、再度 RNA カラムを同じコレクションチューブにセットする。
  11. 200 ul の WB1 を RNA カラムに加える。遠心, 11000 g, 4°C, 1 min。
  12. ろ液を捨て、再度 RNA カラムを同じコレクションチューブにセットする。
  13. 600 ul の WB2 を RNA カラムに加える。遠心, 11000 g, 4°C, 1 min。
  14. ろ液を捨て、再度 RNA カラムを同じコレクションチューブにセットする。
  15. 250 ul の WB2 を RNA カラムに加える。遠心, 11000 g, 4°C, 2 min。
  16. RNA カラムを新しいコレクションチューブ (1.5 ml, フタあり) にセットする。
  17. 10-15 ul の RNase-free H2O を RNA カラムに加え、1 min 待つ。遠心, 11000 g, 4°C, 1 min。
    カラムに吸着した RNA が H2O に溶出される。
  18. 必要に応じて 17 の操作を再度行う。
    これにより、回収される RNA の総量は増えるが、RNA 溶液の濃度は低下する。
  19. RNA カラムを廃棄し、ろ液を RNA 溶液とする。
  20. 微量分光光度計で RNA の濃度を測定する。
  21. -80°C 保存。