分子細胞機能学研究室

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Introduction

チミジンの類縁体である EdU (5-ethynil-2'-deoxyuridine; 5-エチニル-2'-デオキシウリジン) は DNA に取り込まれるため、EdU 存在下でゲノム DNA を合成した (分裂増殖した) 細胞の核を EdU で標識することができる。

Materials

• 培養液
• Click-iT EdU Alexa Fluor Imaging Kit (Thermo, C10337)
• 10 mM EdU stock, -20°C ＠培養室
• 1× Click-iT reaction buf, 4°C
• CuSO₄, 4°C
• Alexa Fluor, -20°C
• 10× reaction buf additive, -20°C
• PBS(-), 染色用, RT
• 0.01% Triton in PBS(-), 4°C
• 0.2% Triton in PBS(-), 4°C
• 2% PFA in PBS(-), 4°C
• DAPI in PBS(-), 4°C
• マウンティングメディウム (ibidi, ib50001), 4°C
• PAP ペン
• カバーガラス (22×22 mm)

Protocol: 3 cm dish

EdU 処理

1. EdU stock を培養液で 1/100 に希釈し、100 uM EdU 溶液を調製する。
2. 培養中の培養液に 1/10 量の EdU 溶液 (最終希釈率 1/1000, 終濃度 10 uM) を加える。
   細胞の増殖速度が変わるので、培地交換はしない。
3. CO₂ インキュベーション, 37°C, 1-6 h。
   マウス筋芽細胞は 3 h で 20-30% の細胞が EdU 陽性、
   ニワトリ筋芽細胞は 3 h で 30% (卵用鶏) - 50% (肉用鶏) が EdU 陽性 (Nihashi 2019)。

EdU 染色

1. 1 ml の PBS(-) で wash, 2回。
2. 1 ml の 2% PFA を加えて固定する。RT, 5 min。
3. 1 ml の 0.01% Triton で wash, 2回。
   0.01% Triton に浸した状態で、4°C で保存可能。
4. 1 ml の 0.2% Triton を加えて透過処理 (細胞膜に孔を開ける)。RT, 5 min。
5. 1 ml の 0.01% Triton で wash, 1回。
6. 細胞が 0.01% Triton に浸かっている状態で、以下の EdU 染色液を調製する。
   各反応成分は、必ず表の順番で加え、加えるごとによく撹拌する。

Total	500 ul	1000 ul	1500 ul	2000 ul
1× Click-iT reaction buf	430 ul	860 ul	1290 ul	1720 ul
CuSO4	20 ul	40 ul	60 ul	80 ul
Alexa Fluor	1.2 ul	2.4 ul	3.6 ul	4.8 ul
10× reaction buf additive	50 ul	100 ul	150 ul	200 ul

7. 0.01% Triton を除去し、PAP ペンで dish の外周をマスクする。
8. 200 ul の EdU 染色液を加える。
9. アルミホイルで遮光してインキュベーション, RT, 30 min。
10. 200 ul の 0.01% Triton で wash, 2回。
11. 200 ul の DAPI を加える。
12. インキュベーション, RT, 5 min。
13. DAPI を除去し、マウンティングメディウムを 1-2 滴垂らす。
14. カバーガラスで封入する。
15. 顕微鏡で観察・撮影する。

Examples

Fig 1. EdU / DAPI

References