プラスミド midiprep
Materials
Protocol
Pre-culture
- 15 ml チューブに 5 ml の LB medium を入れる。
- 大腸菌コロニーを 200 ul チップでつつき、15 ml チューブに入れる。
- 15 ml チューブのキャップを固く閉じ、シェーカーで培養する, 250 rpm, 37°C, O/N。
Culture
- バッフル付フラスコに 200 ml の LB medium を入れる。
- Pre-culture した大腸菌培養液をフラスコに入れる。
- フラスコにシリコセンをし、シェーカーで培養する, 250 rpm, 37°C, O/N。
Midiprep
- 大腸菌培養液をフラスコから 50 ml チューブに移す。
- 遠心, 6000 G, 4°C, 15 min。
- 上清をデカントで大腸菌用廃液ビーカーに捨てる。
廃液にブリーチを加えて滅菌する。
- 10 ml の PX1 で、全てのチューブの大腸菌の沈殿を完全に懸濁してまとめる。
- 10 ml の PX2 を加え、転倒混和し、インキュベーション, RT, 5 min。
- 20 ml の PEQ をカラムのフィルター全体に染み渡らせ平衡化しておく。
- 10 ml の PX3 を加え、転倒混和し、インキュベーション, RT, 5 min。
- 転倒混和してから、50 ml チューブの溶液をカラムのフィルターに移す。
- 溶液が全て流れ出るまで静置。
- 10 ml の PEQ を加え、PEQ が全て流れ出るまで静置する。
- フィルターを廃棄する。
- 15 ml の PW を加え、PW が全て流れ出るまで静置する。
- 新しい50 mlチューブ (白キャップ) にカラムをセットする。
白キャップ 50 ml チューブでないと、後の 15000 G の遠心に耐えられない。
- 10 ml の PE を加え、PE が 50 ml チューブに全て溶出されるまで静置する。＊DNA の溶出
- 7.5 ml のイソプロパノールを加えてボルテックスし、インキュベーション, RT, 2 min。
- 各チューブの重量を測定する。チューブ間に差があれば MQ を加えて均一にする。
- 遠心, 15000 G, 4°C, 30 min。
- デカントで上清をアルコール廃液として捨てる。DNA の沈殿を捨てない！
- 5 ml の 75% EtOH を静かに加える。
- 遠心, 15000 G, 4°C, 10 min。
- デカントで上清をアルコール廃液として捨てる。DNA の沈殿を捨てない！
- チューブのフタを開け、逆さにして乾燥させる。
- 500 ul の MQ を加えてプラスミド DNA を溶解する。
- 1.5 mlチューブにDNA溶液を移す。
- DNA 濃度を測定し、MQ で 1.0 ug/ul に調整する。
DNA 濃度の測定値が 2 ug/ul (2000 ng/ul) 以上のときは、希釈して再測定する。
- -20°C 保存。
