分子細胞機能学研究室

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Introduction

アルカリフォスファターゼ (alkaline phosphatase; ALP) は、未分化な ES/iPS 細胞や、分化した骨細胞で高発現しており、その酵素活性は(未)分化マーカーとして利用される。

Materials

• MQ, 染色用, RT
• PBS(-), 染色用, RT
• 2% PFA in PBS(-), 4°C
• 透過液 (50% EtOH/50% アセトン), -20°C
• ALP 基質液 (ALP/TLAP 染色キット [Wako, 294-67001]), 4°C

Protocol: 24-well plate

ALP 基質液を RT に戻しておく。冷たいままだと充分な酵素反応が生じない。

特に指定のない限り、500 ul/well で操作する。

1. PBS(-) で wash, 2回。
2. 2% PFA を加えて固定する。On ice, 10 min。
3. PBS(-) で wash, 2回。
4. 透過液を加え、-20°C, 1 min。
5. PBS(-) で wash, 2回。
6. 250 ul/well の ALP 基質液を加え、37°C でインキュベーション。
7. 小まめに染色具合を確認し、適切なタイミングで反応を終了する。5~30 min。
8. MQ で wash, 3回。
9. 250 ul/well の MQ に細胞が浸かっている状態で、顕微鏡 (Color, Phase) で観察・撮影する。
10. ALP のシグナル強度を定量する。

Examples

Fig 1. MC3T3-E1 細胞の ALP 染色 / ALP staining of MC3T3-E1 cells

References