ALP シグナルの定量

Introduction

アルカリフォスファターゼ (alkaline phosphatase; ALP) は、未分化な ES/iPS 細胞や、分化した骨細胞で高発現しており、その酵素活性は(未)分化マーカーとして利用される。細胞内 ALP の活性は、ALP 染色によって可視化できるが、ALP 活性は細胞によって異なるため、ALP 陽性細胞率を求めることは困難である。一方、特に骨芽細胞はコンフルエントな状態で ALP 染色に供するため、撮影した視野中の ALP シグナル強度を求めることによって、骨分化の指標とすることができる。

Protocol

ALP 染色像の解析

  1. ImageJ を起動する。
  2. 「File」→「Open...」で解析したい画像を開く。
  3. 「Image」→「Type」→「8-bit」でモノクロ画像 (256階調) に変換する。
    ALP staining monocolor image
  4. キーボードの「M」を押す (「Analyze」→「Measure」と同じ)。
  5. 画像の定量結果が「Results」ウィンドウに表示される。
    表示する項目は「Analyze」→「Set Measurements...」で選択できる。
  6. 解析する画像の数だけ、1~5 を繰り返す。
  7. 解析が終了したら、「Results」ウィンドウの「File」→「Save As...」でファイルを保存する。

ALP シグナル強度の算出

保存したファイルを Excel で開く。

Label Area Mean Min Max
1 Photo-01.tif 3145728 193.5 13 255
2 Photo-02.tif 3145728 143.5 15 255
: : : : : :

「255 - Mean」の値を ALP シグナル強度として算出する。

8-bit の階調値 (0-255) は、小さいほど黒く、大きいほど白い。ALP 染色ではシグナルが暗く見えるので、シグナルが強いほど Mean の階調値が小さくなる。しかしそれではわかりにくいので、逆数を算出している。